無色活體標(biāo)本借助生物顯微鏡。不同的顯微技術(shù)旨在改變相移光與試樣的相互作用將試樣轉(zhuǎn)化為振幅偏移人眼可見的亮度差異。

活體樣本可視化的挑戰(zhàn)

明視野顯微鏡通常只能提供未染色標(biāo)本的微弱圖像，其中只能檢測到一些細(xì)節(jié)。要在圖像中看到更多細(xì)節(jié)，增強對比度非常重要。增強對比度的一種方法是對樣本進(jìn)行染色。然而，這對生物體來說是不可能的，因此它們不會著色，看起來也不明顯。實際上，這些樣本也會與光學(xué)顯微鏡中的入射光發(fā)生相互作用。然而，所發(fā)生的相移是人眼無法察覺的。眼睛只能感受到振幅（亮度）和頻率（顏色）的變化。

對比度是指區(qū)分樣品和背景以及發(fā)現(xiàn)樣品細(xì)節(jié)的可能性。對比度的定義是圖像和相鄰背景之間的光強與整體背景光強之間的差異。對于人眼來說，這些差異至少要達(dá)到百分之二才能被檢測到。使用光電探測器可以大大提高對比度。

然而，對比度不僅取決于樣本及其與光的相互作用本身。用于觀察樣本的光學(xué)系統(tǒng)及其記錄圖像信息的能力也至關(guān)重要。在顯微系統(tǒng)中，對比度取決于正確的光圈設(shè)置、光學(xué)像差的等級、使用的對比度方法、標(biāo)本和探測器。

因此，通過改變光闌的光圈設(shè)置，光學(xué)顯微鏡所獲得圖像的對比度可以不受對比度方法的影響。但是，如果聚光鏡等縮小得太多，分辨率就會受到影響，并可能出現(xiàn)衍射偽影。

要獲得足夠的對比度，最古老的方法可能是先對樣品進(jìn)行染色。通常情況下，這只適用于死物，有時還需要一些復(fù)雜的染色方案。如果要觀察活細(xì)胞，染色就不容易做到。因此，不同的技術(shù)（由適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)顯微鏡提供）旨在將光與樣本相互作用產(chǎn)生的相移轉(zhuǎn)變?yōu)榉啤?/span>

相位對比和微分干涉對比（DIC ）就是這些對比方法的例子。其他光學(xué)對比方法還有暗場對比和偏振對比。

圖 1：振幅對象和相位對象。上排：當(dāng)光線穿過所謂的振幅物體（紅框）時，光波的振幅（A）會降低（ΔA）。人眼會感覺到亮度降低。中間一行：在所謂的相位物體中，光線通過物體時會導(dǎo)致光波的相位移動 (Δj)，人眼無法察覺。下排：未發(fā)生變化的光波。

光與樣本之間的相互作用

如果入射光照射到試樣上，它們就會發(fā)生相互作用。吸收、反射、衍射、光散射和折射都是可能的結(jié)果。在此過程中，入射光波會發(fā)生變化。相位移動和振幅變化都是可能的。在這方面，我們可以區(qū)分相位物體和振幅物體。在理想情況下，相位對象是改變光波相位而非振幅的樣本。相反，振幅對象只影響光的振幅而不影響光的相位。對于可見光而言，扁平和未染色細(xì)胞幾乎達(dá)到了相位對象的特征。由于它們只是導(dǎo)致人眼無法看到的相位偏移，因此在明視野顯微鏡下的對比度非常低。振幅物體本身在明視野顯微鏡中的成像效果非常好。它們會降低振幅，從而降低通過光的強度。染色或自然著色的物體可以在明視野中很好地顯示出來。它們屬于振幅物體。它們會減弱通過的光線，從而減小波面的振幅。但它們并不是理想的振幅物體。除了振幅之外，它們還會影響入射光的成分。它們會吸收或反射特定頻率的光波，而其他波長的光則可以不受阻礙地通過。由于試樣和周圍介質(zhì)的折射率不同，會產(chǎn)生相移。如果光波進(jìn)入細(xì)胞，它會準(zhǔn)減速，而振幅保持不變。當(dāng)光波離開細(xì)胞時，它會恢復(fù)速度，并以與之前相同的頻率、波長和振幅穿過介質(zhì)。然而，與只穿過介質(zhì)的光相比，它的相位發(fā)生了偏移。由于人眼和其他光學(xué)檢測器無法識別和檢測光波的相位變化，因此在未染色和未著色的標(biāo)本中，對比方法的主要目的是產(chǎn)生振幅對比，并將相位對比轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹鶎Ρ取?/span>

圖 2a：兔味蕾切片，相襯顯微鏡

圖 2b：兔味蕾切片，微分干涉對比顯微鏡

圖 2c：兔味蕾切片，明視野顯微鏡

對生物研究產(chǎn)生巨大影響

與使用固定和染色的物體相比，使用未染色標(biāo)本具有許多優(yōu)勢。它允許在生物顯微鏡下觀察活體，沒有固定和染色的人工痕跡。例如，固定和染色會使標(biāo)本收縮或膨脹。此外，還有可能破壞細(xì)胞中的獨特結(jié)構(gòu)或嚴(yán)重改變其形態(tài)。消除這種危險的可靠方法就是使用活體樣本，因為活體樣本沒有偽影，能提供可靠、真實的信息。

活細(xì)胞顯微鏡的另一大優(yōu)勢是可以檢查隨時間變化的情況。除了獲得細(xì)胞的靜態(tài)信息和情況快照外，還可以隨時監(jiān)測整個過程，如細(xì)胞運動、細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡。由于這些過程有時會耗費大量時間，因此最好在光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)中添加一個攝像頭，以記錄延時影片。

不同的光學(xué)對比方法所獲得的信息和印象因其來源而異。因此，建議結(jié)合使用不同的對比技術(shù)，以獲得最準(zhǔn)確、最詳細(xì)的受檢樣本圖像。明視野通常無法準(zhǔn)確觀察細(xì)胞的形態(tài)，而其他光學(xué)對比方法則可以提供更多信息。

在活細(xì)胞圖像中添加熒光標(biāo)記可獲得更多信息。可以用 GFP 等熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)。然后就可以通過光鏡圖像追蹤并準(zhǔn)確確定其在細(xì)胞內(nèi)的定位。此外，還可以將 GFP 與多肽定位信號結(jié)合起來。通過這種方法，像內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這樣的獨特區(qū)塊就可以被可視化。

研究中使用的現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡通常采用模塊化設(shè)計，可以在各種對比方法之間快速切換，甚至可以同時使用。光學(xué)對比方法為在實驗室日常工作中輕松檢查活體和無色標(biāo)本提供了可能。

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